癌症的基本特征包括细胞增殖、血管生成、迁移、凋亡逃避机制和细胞永生等。找到癌症发生过程中这些通路的关键标记物和对应的抗体用于检测至关重要。
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1.溶液和试剂
1）10 X PBS: 80g NaCl，2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1 L纯水，调pH至 7.4
2）包被液：1X PBS
3）洗涤液：含0.05% Tween-20 的1X PBS（1X PBST）或纯水
4）封闭液：10 mg/ml BSA(1% BSA，1X PBS配置)
5）抗体稀释液：一抗、二抗均用1%BSA-PBS
6）2M H2SO4终止显色： 108ml 98%H2SO4，加纯水稀释到1L
2.实验步骤
| 1 | 抗原准备：将抗原按适当浓度溶解于包被液中； |
|---|---|
| 2 | 包被：在对应的孔中加入100μl抗原，37℃孵育2小时或4℃过夜； |
| 3 | 洗涤：倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗5次； |
| 4 | 封闭：每孔加200μl封闭液，37℃孵育1小时； |
| 5 | 洗涤：倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次； |
| 6 | 一抗：每孔加100μl一抗，37℃孵育2小时； |
| 7 | 洗涤：倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗7次； |
| 8 | 二抗：每孔加100μl二抗，37℃孵育1小时； |
| 9 | 洗涤：倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗7次； |
| 10 | 显色：拍干孔中残留液体，每孔加100μl TMB显色液，37℃避光显色10min； |
| 11 | 检测：每孔加50μl 2M H2SO4终止显色，并立即读取450nm OD值。 |