癌症的基本特征包括细胞增殖、血管生成、迁移、凋亡逃避机制和细胞永生等。找到癌症发生过程中这些通路的关键标记物和对应的抗体用于检测至关重要。
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1.试剂和溶液
1）转印缓冲液：0.025M Tris base , 0.187 M甘氨酸 , 25%甲醇
2）氨基黑溶液：0.1% 酸性黑10B
3）1×TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl , 0.1%Tween 20
4）封闭液：TBST配制的5%牛奶
5）抗体稀释液：TBST配制的5%牛奶
6）显色系统：ECL显色
2.实验步骤
| 1 | 电泳：将裂解液进行SDS-PAGE电泳，80v，30分钟，120v，90分钟； |
|---|---|
| 2 | 转膜：PVDF膜在甲醇中浸泡约30秒左右，滤纸浸泡在转印缓冲液预湿，半干法转印到PVDF膜上，10v，150分钟； |
| 3 | 染色：氨基黑染色5分钟，甲醇褪去背景色，观察条带； |
| 4 | 膜活化：将PVDF膜置于甲醇活化1min，用纯水洗膜2次后再用TBST洗涤3次； |
| 5 | 封闭：将膜条置于5%牛奶或2% BSA中，室温混摇2h； |
| 6 | 一抗孵育：将待检抗体用3%牛奶或2% BSA稀释到合适浓度（参照抗体说明书，根据客户预实验结果，稀释度上下浮动一个数量级都为正常），将膜放入对应的已稀释待检样品中，置4℃混摇孵育过夜； |
| 7 | 洗涤：取出膜放在TBST中洗涤3×5min； |
| 8 | 二抗孵育：将膜取出放入稀释好的HRP标记的二抗（参照二抗说明书进行稀释）中，室温混摇2h； |
| 9 | 洗涤：取出膜放在TBST中洗涤3×5min； |
| 10 | ECL显色：将膜取出放入混匀的ECL显色液中，孵育3min，将膜取出贴在有荧光角标的胶片上，迅速用保鲜膜包好； |
| 11 | 曝光：把底片放在暗盒中，根据荧光强度分别对X光胶片作不同时间段的曝光，曝光结束后，将底片取出，1min显影，30s清洗，1min定影，30s清洗，晾干； |
| 12 | 结果分析：用扫描仪将曝光后的X光胶片扫描，做后续结果分析。 |