| 1 | 免疫动物：选取健康Balb/c小鼠一只。 |
|---|---|
| 2 | 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA, Sigma），后用不完全弗氏佐剂（IFA, Sigma）。 |
| 3 | 免疫原：蛋白或KLH偶联的多肽。每次免疫使用50-100μg免疫原。 |
| 4 | 免疫：用PBS稀释免疫原，然后与相应的佐剂1：1混合。抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳化剂，用注射器抽取抗原混合物，于小鼠皮肤下进行多点皮下注射。每点注射0.05-0.1ml。这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答，直到达到要求的效价。 |
| 5 |
第0天 眼眶静脉丛采阴性血清，50ul/只； 第1天 免1：完全弗氏佐剂（CFA）混合的120μg抗原免疫小鼠； 第14天 免2：不完全弗氏佐剂（IFA）混合的60μg抗原免疫小鼠； 第28天 免3：不完全弗氏佐剂（IFA）混合的60μg抗原免疫小鼠； 第35天 采1：血清检测ELISA，1:4000的OD值大于1.0，转阳，融合前3天进行小鼠加免；若低于1.0，继续免疫采血； 第41天 采2； 第42天 免4，免疫方法和免疫剂量同免3。采血是一周采一次，免疫是两周免疫一次。当血清检测的结果阳性后，进行融合。融合前3天进行小鼠加免，将溶解在PBS中的60μg抗原皮下免疫小鼠。 |
| 6 | 杂交瘤融合和筛选：加免3天之后的小鼠，摘眼球取阳性血清，将脾细胞和骨髓瘤细胞F0通过PEG进行融合。培养7天后，用抗原对融合的杂交瘤克隆的上清进行筛选，检测它们的特异性和敏感性，一般都需要进行初筛和复筛。ELISA阳性的克隆可再进行WB检测，筛选出来的克隆至少还需要亚克隆两次，得到稳定分泌抗体的单克隆。 |
| 7 | 大规模抗体生产：筛选得到阳性克隆最后进行大规模上清培养（每个克隆1L）或者生产腹水（每个克隆5只小鼠）。用蛋白A/G对培养液或腹水进行纯化，得到纯化后的抗体，纯化抗体的纯度大于90%。平均每克隆可以得到3-5mg 抗体。 |
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